考马斯亮蓝g250-糖原合成酶激酶（gsk3β）抗体-上海联硕生物科技有限公司

該試劑中含有WST-8，在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

用途：廣泛用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

特點(diǎn)：對細(xì)胞毒性小，可以多次測定選取最佳測定時間；檢測迅速；靈敏度高。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.種板數(shù)：根據(jù)你摸索的，或者查閱文獻(xiàn)確定你需要的種板濃度，根據(jù)種板濃度對細(xì)胞懸液進(jìn)行稀釋，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入約1000-2000個細(xì)胞100ul，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入約5000～10000個細(xì)胞100ul（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。

2.種板：以96孔板為例，96孔板橫向是1-12的數(shù)字，縱向是A-H，可做多個實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置4-6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白組，最邊緣孔加入PBS緩沖液減少蒸發(fā)帶來的影響，然后將細(xì)胞置于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h。

3.加藥及加藥后孵育時間：觀察細(xì)胞細(xì)胞貼壁良好，吸出各孔培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物培養(yǎng)基，然后將96孔板在37℃ 5% CO2空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)細(xì)胞需求選擇適當(dāng)?shù)姆跤龡l件和時間。

4.加入CCK-8：兩種方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液,或者配置成含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基以換液的形式加入,注意加入過程中避免產(chǎn)生氣泡，可以將槍頭浸入培養(yǎng)液中緩慢加入。

5.加入CCK-8后孵育時間：將加完CCK-8的培養(yǎng)板放入37°C 5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育1-4h，CCK-8試劑加入后孵育時間也需要自己摸索，隨著時間的增加，OD值就會增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分別測OD值，把OD值控制在1.0左右。

6.測OD值：將96孔板取出，酶標(biāo)儀檢測各孔在450nm波長處的OD值，分析處理數(shù)據(jù)，繪制增殖曲線。

7.結(jié)果分析：

A．細(xì)胞存活率：將各測試孔的OD值減去本底OD值（空白組）各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)±SD。

細(xì)胞存活率% =(加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD)×100%。

B. 求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)。